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ELISA实验常见问题解析
来源: | 作者:小知识 | 发布时间: 2019-10-06 | 342 次浏览 | 分享到:
ELISA(酶联免疫吸附实验)是指将可溶性的抗原或抗体吸附到聚苯乙烯等固相载体上,进行免疫反应的定性和定量方法。是免疫学研究中最常用的方法之一,可用于测定抗原,也可用于测定抗体。许多人觉得ELISA检测一般有试剂盒或者方法步骤简..............
      ELISA(酶联免疫吸附实验)是指将可溶性的抗原或抗体吸附到聚苯乙烯等固相载体上,进行免疫反应的定性和定量方法。是免疫学研究中最常用的方法之一,可用于测定抗原,也可用于测定抗体。许多人觉得ELISA检测一般有试剂盒或者方法步骤简单,其实在实验过程和结果分析中大家会遇到各种问题,今就和大家分析一下常见的问题,希望对大家有所帮助。
                                                              ELISA实验前准备

1、试剂盒的选择:
     ELISA操作前,应做好实验的设计、选择适合自己检测范围和灵敏度的试剂盒、提前订购和准备试剂及耗材、处理样本等准备工作。
2、样本处理:
     在收集标本前需有一个完整的计划,需要清楚要检测的成份是否足够稳定。ELISA检测提倡新鲜标本尽早检测,对收集后当天就进行检测的标本,及时储存在4℃备用,如有特殊原因需要周期收集标本,请取材后,将标本及时分装后放在-20℃或-80℃条件下保存。因冰室与室温存在一定温差,蛋白极易降解,直接影响实验质量,所以避免反复冻融。
                                                              ELISA实验中的洗涤

      洗涤是ELISA实验中是最多次数的操作,也是非常重要的步骤。不严格的洗涤容易出现洗不干净或交叉污染现象,实验重复效果差的现象。不管用多道加样器、洗瓶、吸管,还是洗板机,严格按照说明书操作不要减少步骤洗涤的洗涤体积、洗涤时间和洗涤次数。注意标准化操作将减少实验误差和不同实验之间的误差。操作者常出现洗板不干净现象,请比照以下操作:
      (1)洗液不要溢出孔外,以免污染相邻的孔,特别是每次洗板的前两遍,若高浓度的孔污染了低浓度的孔或空白孔,其造成的交叉污染的孔是洗不掉的,背景肯定会增高。
      (2)特别注意:设计实验的时候要考虑实验孔的位置,保证甩掉洗液时,空白孔、低浓度孔或阴性对照组在上面或一侧或分开最好。同时注意甩掉洗液的动作翻转(从正上方旋转120-150度)要迅速、干脆。甩板不要手腕左右摇摆、旋转来甩液体,甩出后以直线方式补2-3次甩出液体。
      (3)用干净的滤纸,不要用卫生纸,因为细小粉尘或者碎屑容易吸附到孔底,导致洗板不干净,结果偏高或偏低,重复孔的数值也会相差很大。
      (4)每次拍板不要重复在一个地方拍,特别是洗去酶的步骤;拍板不宜过轻,否则拍不干净,拍板很用力不会对蛋白有什么影响。但注意不要太重,以至把板条给拍断。每次洗板后轻叩几下,最后一次一定要扣干净。
      (5)不能减少洗液体积、洗板时间和次数。洗板时间太短,洗板效果不佳。延长洗板时间和增加洗板次数可以使背景更干净。
                                                                         常见问题解析

ELISA试验出现非常弱的结果,常见有7种原因,其解决方法如下:
      (1)可能原因:温育的时间或者温度不够;
              解决方法:校正温育箱温度。
      (2)可能原因:显色反应时间太短;
              解决方法:校正定时钟准确定时。
      (3)可能原因:所用配制缓冲液的蒸馏水有问题;
              解决方法:使用新鲜合格的蒸馏水。
       ( 4 )可能原因:加入抗体/酶的稀释液浓度太低;
             解决方法:按照说明书保存试剂盒和准确配制工作液。校正移液器,吸嘴要配套,装吸嘴时要紧密。
       ( 5 )可能原因:酶标仪滤光片不正确;
             解决方法:检查酶标仪使用的滤光片。
       ( 6 )可能原因:试剂盒没有充分平衡;
             解决方法:试剂室温平衡至少20分钟,确保所有试剂已平衡至室温。
     (7)可能原因:不正确的试剂储存方式;
            解决方法:按照说明书要求保存试剂盒。
  2、试验的标准曲线和测定的重复性差,这是什么原因造成的?
       答:试验的标准曲线和测定的重复性差,这是典型的由测定操作引起的问题,常见原因如下:
        a)可能原因:加样本及试剂量不准;孔间不一致;
           解决方法:校正移液器,吸嘴要配套,装吸嘴时要紧密。重复某一样品时,加样时间尽可能与第一次接近;重复测定标本,操作条件、人员等应尽可能与上次保持一致,以排除这些因素造成的不一致的可能性;样品稀释前应充分混匀。
        b)可能原因:加样过快,孔间发生污染;
             解决方法:重复测定标本,操作条件、人员等应尽可能与上次保持一致,以排除这些因素造成的不一致的可能性;加样不要过快。         
        c)可能原因:加错样本;
           解决方法:检查记录
        d) 可能原因:加样本及试剂时,加在孔壁上部非包被区;
            解决方法:加样枪头不要贴壁。
        e)可能原因:不同批号试剂盒中组分混用;
           解决方法:不同批号试剂盒中组分不可混用。
        f)可能原因:温育时间、洗板、显色时间不一致;
          解决方法:检查时间是否一致。
        g)可能原因:孔内污染杂物;
           解决方法:离心样品,排除杂物。
         h)可能原因:试剂/样品没有混匀;
            解决方法:充分混匀样品和试剂。
3、试验结果白板,而且阳性对照不显色,应如何分析和查找原因?
     答:试验结果白板,常见原因如下:
     a)可能原因:漏加或者误加试剂;
        解决方法:检查试验记录和剩余试剂。每次加液前均应核对标签。
     b)可能原因:试剂过期;
        解决方法:使用有效期内的产品。
     c)可能原因:洗板液配制中出现问题,如量筒不干净含HRP酶抑制物(叠氮钠 
等);
        解决方法:使用干净的器皿,正确配制试剂。
     d)可能原因:温育的时间或温度不够;
        解决方法:校正温育箱温度。
     e)可能原因:抗体失活或者丢失;
       解决方法:更换抗体或者提高抗体浓度
     f)可能原因:酶失活或者丢失
       检查方法:把工作浓度的酶再稀释20-100倍,取5uL加入50ul的显色底物,终止后显色是否能达到1.0左右,此为酶的粗略估计。
       解决方法:更换酶或者提高酶的浓度。  
    g)可能原因:显色底物失活
       检查方法:加少量的工作浓度的酶,TMB是否很快显色。
       解决办法:更换显色底物。
4、试验结果白板,而且阳性对照不显色,应如何分析和查找原因?
     答:试验结果空白背景高,常见原因如下:
     a)可能原因:洗板不干净;
        解决方法:充分洗涤,彻底拍干;洗板要防止交叉污染;浓缩洗液准确配制;吸嘴尽可能一次性使用;加样或加酶拍板的滤纸应弃去不用,不要反复使用,否则易造成污染。
     b)可能原因:显色液变质或者试剂过期;
        解决方法:检查试剂盒有效期。
     c)可能原因:试剂稀释有误,如加酶的浓度过高;
        解决方法:请按说明书所示稀释倍数配制;
     d)可能原因:蒸馏水受酶等污染;
        解决方法:使用新鲜蒸馏水;
      e)可能原因:试剂混用;
         解决方法:不同批号试剂勿混用。
       f)可能原因:培养箱温度超过37℃或反应时间过长。
         解决方法:显色反应时间适当缩短。
                                                                        最后一问
5、OD值换算成样本浓度,出现了负值,该如何处理?
     1.血清浓度过高,大分子杂蛋白遮盖了抗原表位,检测血清时要做相应的稀释(按试剂盒说明书建议);
     2.标准曲线只取下面的4~5个浓度,把样本的OD值全包括,这样就把标准曲线的下端(样本浓度集中的一段)放大了。
     3.把0pg/ml点的OD值降低,低于最低样本的OD值,同时保证标准曲线的相关系数(r>0.98),这样低的样本值是正值,高的样本值会更高。
     4.拟合标准曲线时,用四参数拟合分析。

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